8012了，高通量測(cè)序早已非常普遍，走在生命科學(xué)前沿的研究者們幾乎都在談?wù)?/span>Single-Cell Sequencing對(duì)于整個(gè)生命科學(xué)研究的意義以及價(jià)值。無(wú)論是腫瘤、發(fā)育、神經(jīng)科學(xué)，還是血液免疫或者其他領(lǐng)域，生物學(xué)研究似乎進(jìn)入了一個(gè)新的時(shí)代——單細(xì)胞時(shí)代（Single Cell Era），我們的視野越來(lái)越精準(zhǔn)，從一塊組織轉(zhuǎn)為一塊組織中的每一個(gè)細(xì)胞。就比如，在乳腺癌中，Single-Cell Seq揭示了三陰性乳腺癌患者受到化療后，部分患者反而生存時(shí)間縮短，究其原因，是因?yàn)槟[瘤異質(zhì)性引起的耐藥克隆的存在。

Kim C, Gao R, Sei E, et al. Cell, 2018, 173(4): 879-893. e13.

目前在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、頭頸部癌等、多種腫瘤研究中，單細(xì)胞測(cè)序都有廣泛的應(yīng)用，涉及腫瘤異質(zhì)性、耐藥、微環(huán)境等各方面的研究，比如下面這篇研究頭頸鱗癌的EMT效應(yīng)的異質(zhì)性的文章。

Puram S V, Tirosh I, Parikh A S, et al. Cell, 2017, 171(7): 1611-1624. e24.

說(shuō)了這么多關(guān)于Single-Cell測(cè)序的應(yīng)用情況，可能很多人還對(duì)于Single Cell是什么，它的準(zhǔn)確定義是什么不是特別清楚，可能也會(huì)疑惑它和普通的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序又有什么區(qū)別呢？能得到什么不一樣的結(jié)果呢？也可能會(huì)有朋友說(shuō)，我連PCR產(chǎn)物都擴(kuò)不出來(lái)的單細(xì)胞樣本，究竟是如何單個(gè)獲得的呢？這里就簡(jiǎn)單給大家說(shuō)說(shuō)。

Single Cell測(cè)序技術(shù)，即利用優(yōu)化后的高通量測(cè)序技術(shù)（NGS，Next Generation Sequencing）分析每一個(gè)單個(gè)細(xì)胞的序列信息，從而更高分辨率地揭示細(xì)胞間的細(xì)胞差異以及其在微環(huán)境中的功能情況。

So Why Single Cell？有必要做的這么復(fù)雜么？真的有必要以一個(gè)細(xì)胞為單位進(jìn)行研究么？這里就需要我們從Bulk RNA-Seq和Single Cell RNA-Seq的結(jié)果差異的角度出發(fā)說(shuō)一些故事了。

眾所周知，任何一個(gè)組織實(shí)際上都是一個(gè)個(gè)細(xì)胞組成的，我們進(jìn)行的所謂Bulk RNA Seq，也就是我們一直說(shuō)的普通轉(zhuǎn)錄組測(cè)序就是基于這個(gè)組織塊的所有的RNA的基因表達(dá)。我們一直用這個(gè)整體的基因表達(dá)來(lái)代表這個(gè)組織塊的基因表達(dá)，然而從已有的免疫學(xué)、發(fā)育學(xué)以及神經(jīng)學(xué)的研究中，都發(fā)現(xiàn)，在一個(gè)組織或者細(xì)胞簇中會(huì)存在不同類(lèi)型的細(xì)胞，它們的基因表達(dá)以及功能也是各不相同的，這就是我們所說(shuō)的細(xì)胞間異質(zhì)性。就以免疫細(xì)胞為例，我們會(huì)發(fā)現(xiàn)里面有T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等等，并且T細(xì)胞中還存在T-Reg、T-Na?ve、T-Active等細(xì)胞，而且這些T細(xì)胞上連接的TCR也是各不相同的，這其中存在著錯(cuò)綜復(fù)雜的分類(lèi)。然而這還只是血細(xì)胞中的情況，胚胎發(fā)育、大腦不同腦區(qū)神經(jīng)發(fā)育等過(guò)程中的細(xì)胞轉(zhuǎn)變更是令人難以想象。可以這么說(shuō)，隨著我們對(duì)于細(xì)胞的細(xì)分，很多我們?cè)?jīng)在教科書(shū)上見(jiàn)過(guò)的研究結(jié)果已經(jīng)不再是金標(biāo)準(zhǔn)了。

正是在這個(gè)時(shí)代，衍生出了一種替代技術(shù)，我們稱(chēng)之為微量細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，研究者基于T細(xì)胞、B細(xì)胞等這些細(xì)胞的表面抗原，采用FACS技術(shù)或者MACS技術(shù)進(jìn)行捕獲后，將細(xì)胞數(shù)量極微量的樣本的RNA，采用擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增放大后進(jìn)行測(cè)序。這個(gè)技術(shù)一定程度上解決微量細(xì)胞檢測(cè)的困難，但是仍然有非常多的問(wèn)題，比如PCR會(huì)產(chǎn)生PCR bias，而這個(gè)問(wèn)題在ctDNA檢測(cè)中也很早就被觀察到了。

為了解決PCR bias干擾基因表達(dá)的問(wèn)題，unique molecular identifier （UMI）技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。主要原理是擴(kuò)增前每一個(gè)轉(zhuǎn)錄本序列在添加一段獨(dú)有的隨機(jī)序列，長(zhǎng)度為6-10個(gè)bp，以此來(lái)為一條轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行命名。一條UMI下的一條對(duì)應(yīng)序列，不管如何進(jìn)行PCR，，不論擴(kuò)增多少次，都只計(jì)算一次。隨著這類(lèi)概念的提出，可測(cè)單細(xì)胞數(shù)量在2014年-2016年之間呈現(xiàn)指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，單細(xì)胞分選測(cè)序技術(shù)也正式進(jìn)入了黃金發(fā)展階段。

隨著MARS-Seq，CytoSeq（后續(xù)發(fā)展為BD Rhapsody®技術(shù)）以及Drop-Seq（后續(xù)發(fā)展為10X Genomics®技術(shù)）的出現(xiàn)，人類(lèi)正式可以對(duì)于一個(gè)組織或者大量細(xì)胞樣本中的細(xì)胞進(jìn)行單個(gè)測(cè)定了，進(jìn)入了10⁴的時(shí)代。

隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的深入應(yīng)用，它的應(yīng)用從細(xì)胞類(lèi)樣本，開(kāi)始轉(zhuǎn)向組織類(lèi)樣本，從PBMC這類(lèi)早期通過(guò)FACS流式分選技術(shù)/MACS磁珠分選技術(shù)即可獲得分類(lèi)的組織樣本，轉(zhuǎn)向Solid Tumor Tissue這類(lèi)固態(tài)的具有大量基質(zhì)細(xì)胞和混合細(xì)胞，并且存在細(xì)胞間連接的樣本，這時(shí)候，單細(xì)胞測(cè)序開(kāi)始遇到數(shù)不清的困難和瓶頸。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程上來(lái)說(shuō)，也是障礙重重。首先如何將組織解離為細(xì)胞個(gè)體？不同組織的條件完全不同，膠原酶I-V，木瓜蛋白酶，根據(jù)不同組織類(lèi)型，處理時(shí)間完全不同。其次，如何將組織處理完畢后，保證細(xì)胞大部分存活？死細(xì)胞比率直接決定測(cè)序和分析結(jié)果的成功與否。那么又有哪些策略可以快速過(guò)濾死細(xì)胞？如何去除無(wú)意義的紅細(xì)胞？去紅細(xì)胞是否會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)變化？如何保證采樣時(shí)間一致？?jī)龃婕?xì)胞是否可以使用？否則無(wú)法做前瞻性樣本收集，只能做回顧性樣本收集了。

數(shù)據(jù)分析上來(lái)說(shuō)，不同的技術(shù)不同的barcode設(shè)計(jì)完全不同，如何兼容？如何快速分析150Gb的測(cè)序數(shù)據(jù)？如何準(zhǔn)確區(qū)分UMI定量？如何去除死細(xì)胞？如何去除雙細(xì)胞？如何去除批次效應(yīng)？是否需要添加Spike-In？采用什么策略進(jìn)行樣本標(biāo)準(zhǔn)化？如何準(zhǔn)確獲得細(xì)胞數(shù)量？如何評(píng)估Hooping？問(wèn)題一籮筐?。?/span>

而更關(guān)鍵的從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上來(lái)說(shuō)，到底應(yīng)該如何設(shè)計(jì)樣本的分組，如何比較差異，如何找到真正具有生物學(xué)意義的問(wèn)題，也是迫在眉睫的挑戰(zhàn)。隨著單細(xì)胞技術(shù)的持續(xù)發(fā)展，多組學(xué)、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、基因組、CNV、甲基化、表面組都會(huì)成為可能，與臨床數(shù)據(jù)間究竟該如何討論？之前的Bulk RNA Sequencing數(shù)據(jù)是從此可以進(jìn)行埋葬，還是有其可以應(yīng)用的方式和策略？

所以，哪怕以今天的角度來(lái)看，Single-Cell技術(shù)都還不是一個(gè)完全成熟的技術(shù)，而是一個(gè)飛速發(fā)展的技術(shù)，有別于lncRNA、circRNA這類(lèi)新的研究方向的誕生，Single Cell可以說(shuō)是對(duì)于現(xiàn)有樣本和理論的一場(chǎng)新的革新，從宏觀進(jìn)入微觀，如同物理學(xué)以及化學(xué)一樣，必將帶來(lái)顛覆性新的結(jié)論，而我們每一個(gè)人都是這個(gè)潛在的嶄新時(shí)代的見(jiàn)證者和親歷者。烈冰也會(huì)陸續(xù)分享一些單細(xì)胞測(cè)序有關(guān)實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析的關(guān)鍵技術(shù)，歡迎關(guān)注哦^^