大家好！又見面啦！我是你們的烈小冰，今天給大家?guī)硪黄韶浿械母韶洠v講單細胞測序中至關重要的一步——單細胞的分離。

上次跟大家聊的細胞消化懸浮方案反響不錯，各位老師都比較認可，銷售部同事訂單增加不少，BOSS也給加了雞腿。今天烈小冰再次請到了平時神龍見首不見尾的烈冰實驗團隊ACE Mr.Wang跟大家再深入地多聊一些實驗技術的具體操作問題。

上一回我們按照研究方向進行了分類和舉例，今天我們更細致一點，Mr.Wang以親自上手做過的一些樣品為例，按照不同組織/細胞類型進行實驗技巧分享。

1. 肝臟：研究領域為肝癌、肝炎及消化性肝臟疾病，代表性物種為人、大/小鼠等。

肝臟可能是目前單細胞測序領域的一個重要分支，畢竟我國乙肝、丙肝及相應肝癌的患者數(shù)量確實太多了。無論是SCI文章還是中文核心期刊文章，大多數(shù)protocol都是很相似的，100-200 IU/ml的II型膠原酶，剪碎成小塊（1-2 mm³），37℃水浴消化30 min-4 h。根據(jù)自己實測的人肝癌和小鼠肝臟樣品結果來看，肝組織都很大，20 min的消化時間，就能拿到足夠多的單細胞了，畢竟細胞數(shù)量能夠達到10^5級別即可（What!不是說上機1萬個細胞么？不要著急，后文在注意事項中會解釋具體原因）。Moreover，也有一些課題組應用II+IV型膠原酶的混合液對肝臟組織進行兩次灌注：i）第一次灌注，37℃預熱的D-hanks`液，從門靜脈進入沖洗肝組織內部的血液；ii）第二次灌注，II+IV型膠原酶，門靜脈進入，通過流動的消化液逐步“侵蝕”肝臟內部血管內皮以及肝細胞之間的細胞連接，使組織塊松散。后續(xù)使用組織剪和鑷子進行物理撕裂分離，過70 um細胞篩。需要注意的是，整個灌注過程需要高壓注射泵來保持恒定的速度，而且，本方法一般適用于動物原代肝細胞的分離，對于已經(jīng)切除的肝癌組織，灌注法不太適用。

注意！紅細胞裂解液！紅細胞裂解液！紅細胞裂解液！請實驗人員務必提前準備好新買的、質量好的紅細胞裂解液！鑒于肝臟的解剖學和功能特性，其內部含有大量的血液；而紅細胞對測序結果有一定影響，裂紅這一部分必不可少。因此，要注意的是裂紅試劑最好新買，根據(jù)離心后細胞團中紅色細胞的含量/比例盡量一次處理完畢，不要裂紅兩次（細胞活性影響大），裂紅時間能短就不要長（一般不超過5 min）。信了說明書的邪，37℃裂紅5 min，操作2次，細胞活性下降很多。

2. 脾臟：研究領域為免疫相關研究，代表性物種為大/小鼠。

脾臟作為最大的外周免疫器官，其內部含有大量的淋巴細胞和巨噬細胞，是進行病原感染及基礎免疫學研究最常用的器官，也是我最喜歡的組織之二（另一個是腎臟）。操作方面滿滿的優(yōu)點，無論是剪碎后IV型膠原酶的消化（仍然是100-200 IU/ml，37℃，20-30 min），還是直接暴力研磨，都能拿到很多很好的單細胞懸液。用東北話講，抗霍霍。提醒一點，把脾臟離體后，立刻用銅網(wǎng)研磨，邊研磨邊加入完全RPMI-1640培養(yǎng)液（10% FBS），保證研磨過程中，單細胞會及時被培養(yǎng)液沖洗過銅網(wǎng)，而細胞團塊以及一些成纖維細胞、血管內皮等不能通過銅網(wǎng)，銅網(wǎng)直徑一般是50-70 um，請自行換算成目數(shù)。

3. 腎臟：研究領域為內分泌、外周免疫損傷、腎炎等，代表性物種為人、大/小鼠病例模型。

由于腎臟外存在一層相對致密的膜，且解剖學結構很復雜（內部有皮質髓質腎盂腎盞，外部還有一些腺體），制備單細胞懸液的時候，務必要用手術剪或者刀片把組織切得很碎，這樣后續(xù)消化得到的細胞中，對應各解剖結構的細胞類型才足夠豐富。當然，也跟一些老師交流過，初步剪碎后，通過暴力研磨也可以拿到足夠好的細胞（也很抗霍霍），后續(xù)可以試試。我們親測的結果，IV型膠原酶常規(guī)消化流程，可以拿到10^7級別且活性相當高的單細胞懸液，很高效。

4. 外周血來源的單細胞：研究領域為基礎免疫學、免疫相關疾病、內分泌相關疾病等，代表物種為人或者轉基因小鼠。

這部分實驗，需要先區(qū)別2個名詞：白細胞和外周血單個核細胞（PBMCs）。血液通過EDTA管子（不能用肝素管?。。。┛鼓?，直接裂紅處理，得到的細胞沉淀是白細胞；用淋巴細胞分離液得到的中間云霧層，是PBMCs。主要的差別在于白細胞包含嗜酸/嗜堿/中性粒等細胞，而PBMCs沒有。

隨后，我們可以開始實驗了。無論是直接裂紅，還是密度離心，拿到目的細胞群后，一般都是素質三連（離心---棄上清---洗液重懸），然后計數(shù)+計活性，最后混勻稀釋到一定數(shù)量后上機鋪板。整個流程是最簡單易行的了。

延伸一些，如果老師們的研究目的細胞群體是某一個亞群的細胞，比如造血干細胞，勢必會用幾種顏色的直標抗體進行FACS分選。這里會衍生出2個實際會遇到的難題：i）目的細胞數(shù)量太少，達不到10^5級別；ii）FACS分選后，細胞活性也可能不太好。

針對i）數(shù)量少的問題，如果原始來源的細胞量足夠，可以通過多批次磁珠富集的方法，收集足夠多的細胞，比如肝臟內部的巨噬細胞（Kupffer細胞）在組織內含量很低，直接分離可能數(shù)量太少，建議通過磁珠富集的方法進行。又或者Treg細胞，正常狀態(tài)下，僅占PMBSs總量的1%左右。乖乖用磁珠富集了pool在一起再做后續(xù)實驗吧。而問題ii），就比較困擾。FACS分選，看似是機器自己操作，但不同的操作人員的操作習慣、實驗手法、以及機器配置對細胞活性都有影響。實在無法避免這一步驟的話，請先做預實驗，摸索穩(wěn)定的分選條件。另外，有一點是本人還未想通的。FACS分選時，標記抗體越多，拿到的細胞同質性越高，數(shù)量也越少；而問題是，單細胞測序，本身就是要測細胞群體的異質性。拿同質性很高的細胞來做異質性分析，理論上是可行的（萬一里面確實有不同的細胞亞群呢，不就發(fā)達了么？！CNS不就隨便發(fā)了么？！），只不過聽起來乖乖的，而且數(shù)量不夠這個問題，一定會影響后續(xù)實驗。怎么辦？個人推測，如果目的細胞群體在總細胞中的含量并不是很低的話，其實可以直接拿總細胞群體去做實驗，通過后續(xù)的tSNE分析來進行亞群區(qū)分以及biomarker分析來確定每一群的marker gene。當然，如果目的細胞亞群數(shù)量很少，可能占比10%左右，直接RUN總細胞確實會造成低豐度細胞亞群的細節(jié)損失。怎么辦？這時就需要靈活一點，少染幾個染色的抗體，多pool幾個樣本做混池，間接提高目的細胞亞群在總細胞內的相對比例。

請注意，以上推測僅僅是為了實驗能夠順利進行的一些折中方式，可能在后續(xù)分析中會有一定的影響，還沒有最終的結論，請勿直接使用。如果造成不必要的損失，也就只能讓烈小冰把BOSS給的雞腿賠給你了。

最后解答一下前面預留的問題：

不是說上機1萬個細胞么？怎么又需要提供10^5級別的細胞？

提供的總細胞量與實際上機細胞量，是兩個概念。老師提供了總細胞，需要經(jīng)過幾次buffer的素質三連（沉淀—棄上清—重懸），又有可能被裂紅，還要過細胞篩去除細胞團塊。這一系列操作，會丟失大量的細胞（實驗手法的穩(wěn)定性，在這一步就體現(xiàn)出來了），而且這些丟失無論是用何種平臺都是無法避免的。因此，如果最初老師提供的總細胞量低于10^5這個數(shù)量級，一系列操作后可能無法滿足1萬個細胞的上機要求。這時候就只有兩個選擇：i）直接上機，硬做；ii）通過sample label抗體和其他樣品進行pool樣混合上機，最后通過數(shù)據(jù)分析來區(qū)分（套路等同于NGS的樣品間INDEX）。

好了，今天的單細胞分離實驗技術分享就到這里，烈小冰去吃雞腿了，非常感謝Mr.Wang誠意滿滿的實戰(zhàn)經(jīng)驗分享，我們下期再見！

烈小冰受同事之托，對前幾日為烈冰上門做實驗的人員提供包宿的同學表達感謝，跟烈冰一起犧牲休息時間完成單細胞實驗真的辛苦了！也非常感謝對烈冰的信任，將重要的項目托付給我們，烈冰定不會讓你們失望！