在高通量測(cè)序領(lǐng)域，流傳著一句話(huà)，叫做“Junk in, junk out.”，這就意味著要想得到一個(gè)好的數(shù)據(jù)分析結(jié)果，就需要對(duì)前期的每一步操作都進(jìn)行嚴(yán)格的把關(guān)，包括樣本的制備、測(cè)序以及數(shù)據(jù)的前期處理等。在整個(gè)單細(xì)胞測(cè)序?qū)嶒?yàn)過(guò)程中，前期樣本的選取以及單細(xì)胞懸液的制備是整個(gè)實(shí)驗(yàn)成敗的第一步。當(dāng)獲得單細(xì)胞懸液之后，如何精準(zhǔn)的判斷細(xì)胞的質(zhì)量、監(jiān)控單個(gè)細(xì)胞的分選效果則顯得更為重要，因?yàn)檫@一步直接關(guān)系著最后測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量以及數(shù)據(jù)分析結(jié)果的好壞。因此就需要對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)控和記錄。

NovelBio使用的單細(xì)胞分選系統(tǒng)（BD Rhapsody）可以對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中從單細(xì)胞懸液質(zhì)量評(píng)估到Single Cell分選標(biāo)記的每一個(gè)步驟進(jìn)行質(zhì)控及記錄，包括單細(xì)胞懸液中細(xì)胞數(shù)量、活性的檢測(cè)，單細(xì)胞分選標(biāo)記過(guò)程中細(xì)胞、磁珠的鋪板情況、細(xì)胞被磁珠捕獲標(biāo)記的情況以及雙細(xì)胞的比例等，在獲取實(shí)驗(yàn)過(guò)程中關(guān)鍵信息的同時(shí)，也有效保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

圖1 BD Rhapsody單細(xì)胞分選系統(tǒng)

1、 單細(xì)胞懸液質(zhì)量評(píng)估

細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞活性的精準(zhǔn)判斷對(duì)Single Cell分選標(biāo)記、建庫(kù)、下機(jī)數(shù)據(jù)的質(zhì)量都具有著決定性的作用。如若細(xì)胞計(jì)數(shù)偏高，將會(huì)影響建庫(kù)的成功率；計(jì)數(shù)偏低，則會(huì)顯著提高雙細(xì)胞的比例；而細(xì)胞活率過(guò)低，就會(huì)使測(cè)序數(shù)據(jù)的利用率大打折扣，因此把好單細(xì)胞懸液質(zhì)量這一關(guān)尤為重要。

BD Rhapsody單細(xì)胞分選系統(tǒng)集成了熒光顯微成像系統(tǒng)，可以對(duì)不同熒光標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)數(shù)。在進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估之前，首先要將細(xì)胞的培養(yǎng)體系更換成上機(jī)所需的Buffer。在這個(gè)過(guò)程中，需要進(jìn)行多次離心、重懸操作，Novelbio單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)推薦采用水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)來(lái)進(jìn)行這步操作（下圖左）。這種離心機(jī)可以有效減少細(xì)胞在多次更換Buffer過(guò)程中的損失，尤其是對(duì)于細(xì)胞量較少的樣本來(lái)說(shuō)，顯得非常有必要。更換完Buffer之后，還需要將細(xì)胞進(jìn)行過(guò)篩操作，去除較大的細(xì)胞團(tuán)，獲得較為純凈的單細(xì)胞懸液。

圖2 單細(xì)胞重懸、過(guò)篩操作

在更換完Buffer之后在實(shí)驗(yàn)中，可以通過(guò)Calcein AM和Draq7對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，兩種染料分別標(biāo)記單細(xì)胞懸液中的活細(xì)胞以及死細(xì)胞，37℃避光孵育后（下圖左上），將細(xì)胞懸液加入血球計(jì)數(shù)板（下圖左下），載入BD Rhapsody單細(xì)胞分選系統(tǒng)中進(jìn)行熒光顯微成像（下圖右），對(duì)細(xì)胞的狀態(tài)進(jìn)行評(píng)估。

圖3 細(xì)胞染色并上機(jī)檢測(cè)

當(dāng)BD Rhapsody單細(xì)胞分選系統(tǒng)對(duì)染色后的細(xì)胞進(jìn)行掃描并照相后，根據(jù)明場(chǎng)及熒光成像結(jié)果，可以對(duì)單細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量、活細(xì)胞比例進(jìn)行計(jì)算，進(jìn)而對(duì)單細(xì)胞懸液的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果如下圖所示，其中左上、右上、左下分別為同一視野下的明場(chǎng)、綠色熒光、紅色熒光結(jié)果，右下為數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，計(jì)算并獲得了細(xì)胞總數(shù)及活細(xì)胞比例。

圖4 細(xì)胞計(jì)數(shù)及活性檢測(cè)結(jié)果

2、 細(xì)胞鋪板

當(dāng)單細(xì)胞懸液滿(mǎn)足鋪板要求后，就可以進(jìn)行單細(xì)胞分選標(biāo)記操作了，在這一步，主要用到的儀器和耗材有如下幾種，分別為BD Rhapsody單細(xì)胞分選儀（下圖左上），BD Cartridge單細(xì)胞分選蜂巢板（下圖右上），BD Rhapsody 電動(dòng)移液器（下圖左下）。

圖5 BD Rhapsody單細(xì)胞鋪板設(shè)備及耗材

在單細(xì)胞的鋪板過(guò)程中，由于不同操作人員手法具有不可避免的差異，不同的液體流速將直接影響單細(xì)胞的入孔效果。因此BD Rhapsody分選平臺(tái)還專(zhuān)門(mén)配套了定制的電動(dòng)移液器，其具有Prime Treat、Cell Load、Bead Load、Wash、Lysis、Retrieval多種操作模式，來(lái)對(duì)應(yīng)各種不同的操作。通過(guò)已經(jīng)設(shè)定的程序來(lái)控制液體的流速，大幅度降低人為操作習(xí)慣帶來(lái)的差異，保證實(shí)驗(yàn)操作的一致性。

圖6 BD Rhapsody單細(xì)胞分選定制電動(dòng)移液器

根據(jù)已有的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，將單細(xì)胞懸液稀釋到合適的鋪板濃度后，就可以進(jìn)行鋪板操作了。待細(xì)胞因重力落入蜂巢孔內(nèi)后，可以通過(guò)BD Rhapsody成像系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞的真實(shí)入孔情況進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)圖像結(jié)果可以清楚看到每個(gè)孔內(nèi)是否有細(xì)胞落入以及落入多少個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)并評(píng)估實(shí)際的鋪板效果。（下圖）。

圖7 BD Rhapsody單細(xì)胞分選系統(tǒng)細(xì)胞鋪板情況檢測(cè)

3、 磁珠鋪板及清洗

待細(xì)胞鋪板完成后，就需要往BD Cartridge蜂巢板中加入過(guò)量磁珠，來(lái)保證大部分孔內(nèi)都能夠落入磁珠（下圖左），隨后再用Buffer清洗去除多余的磁珠（下圖右）。整個(gè)過(guò)程同樣可以通過(guò)BD Rhapsody成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描，評(píng)估磁珠的實(shí)際鋪板情況，并統(tǒng)計(jì)分析得到細(xì)胞和磁珠落入同一孔內(nèi)的數(shù)量，獲得細(xì)胞的真實(shí)捕獲情況。

圖8 BD Rhapsody單細(xì)胞分選系統(tǒng)磁珠鋪板情況檢測(cè)

4、 細(xì)胞裂解及磁珠收集

當(dāng)蜂巢孔內(nèi)同時(shí)落入細(xì)胞和磁珠后，接下去可以往BD Cartridge板中加入細(xì)胞裂解液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，使細(xì)胞內(nèi)的RNA與磁珠上的標(biāo)簽進(jìn)行結(jié)合，完成每個(gè)細(xì)胞內(nèi)RNA的捕獲和標(biāo)記。這時(shí)，再將捕獲了RNA的磁珠進(jìn)行回收，待所有質(zhì)控結(jié)果確認(rèn)通過(guò)后就可以進(jìn)行后續(xù)的RNA反轉(zhuǎn)錄、cDNA第二鏈合成等實(shí)驗(yàn)操作。而BD Cartridge板則需要再進(jìn)行一次成像，獲得磁珠收集后的掃描圖，判斷磁珠是否已經(jīng)被有效收集。

圖9 BD Rhapsody單細(xì)胞分選系統(tǒng)磁珠收集后檢測(cè)圖

5、 實(shí)驗(yàn)總結(jié)報(bào)告

根據(jù)每一步的質(zhì)控結(jié)果，烈冰科技（NovelBio）單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)會(huì)根據(jù)單細(xì)胞分選的實(shí)驗(yàn)結(jié)果生成實(shí)驗(yàn)總結(jié)報(bào)告，判斷每一步驟是否通過(guò)質(zhì)控，并得到最終捕獲的單細(xì)胞數(shù)量以及雙細(xì)胞比例，對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行總結(jié)評(píng)估。若所有過(guò)程通過(guò)質(zhì)控，實(shí)驗(yàn)樣本即可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)操作。

圖10 實(shí)驗(yàn)總結(jié)報(bào)告

6、 烈冰團(tuán)隊(duì)助力單細(xì)胞研究

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)（Single Cell Sequencing）從一種新興的研究角度，借助已有的高通量測(cè)序手段，幫助研究者在腫瘤異質(zhì)性、腫瘤微環(huán)境、發(fā)育學(xué)、免疫學(xué)以及其他領(lǐng)域中進(jìn)行單細(xì)胞層面的數(shù)據(jù)解析，解決了Bulk Population Sequencing所無(wú)法解決的問(wèn)題。這樣一個(gè)新的研究領(lǐng)域必然也需要足夠可靠的實(shí)驗(yàn)手段來(lái)支撐。BD Rhapsody單細(xì)胞分選系統(tǒng)為此提供了完善的硬件設(shè)備，保證了從單細(xì)胞懸液質(zhì)量評(píng)估到單細(xì)胞分選標(biāo)記過(guò)程中每一個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟的精準(zhǔn)質(zhì)控。NovelBio單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)借助BD Rhapsody單細(xì)胞分選系統(tǒng)，在實(shí)驗(yàn)實(shí)施層面對(duì)單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果的可靠性提供了強(qiáng)有力的保證。繼單細(xì)胞懸液制備之后，又在另一道關(guān)鍵關(guān)卡提供了可靠的支持，幫助研究者在單細(xì)胞測(cè)序領(lǐng)域收獲更多的成果。