骨折是最常見的骨創(chuàng)傷疾病，其愈合由成骨細胞和破骨細胞共同作用調(diào)節(jié)。已有研究表明B細胞影響了破骨細胞和成骨細胞的分化，但是由于骨折愈合過程中骨髓微環(huán)境的復(fù)雜性，B細胞在骨折愈合中的作用機制尚不清楚。

今天小編為大家?guī)砹艘黄傻诙娽t(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院紀(jì)方教授團隊在Frontiers in Endocrinology（IF=5.555）發(fā)表的題為“Single-Cell RNA Sequencing Reveals B Cells Are Important Regulators in Fracture Healing”的文章，揭示了B細胞在骨折愈合過程中發(fā)揮的重要作用，對骨折等骨疾病治療策略具有重要意義。

烈冰生物參與了本次單細胞測序?qū)嶒灪蛿?shù)據(jù)分析工作，下面請跟隨小編的步伐，來看看這篇文章的研究思路和結(jié)果分析吧~

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樣本信息

1例（＜5 d）骨折組織

1例（＞30d ）骨折組織

小鼠骨折組織（0、3、7、14d）

技術(shù)手段

單細胞轉(zhuǎn)錄組測序

免疫熒光、免疫印跡、TRAP染色

捕獲平臺

BD Rhapsody

研究結(jié)果

1、骨折組織的單細胞圖譜分析

研究者總共對9339個細胞進行了單細胞測序，通過細胞聚類分析和鑒定，獲得了13種細胞類群，包括6個中性粒細胞群、2個早期紅細胞群、2個T細胞群、1個B細胞群、1個漿細胞群和1個單核細胞群。另外對比新、舊骨折組織的細胞群發(fā)現(xiàn)，B細胞在數(shù)量上存在顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（圖1）。

圖1 人新、舊骨折組織單細胞圖譜

2、骨折組織的B細胞鑒定

為了探究B細胞在骨折愈合中的作用，研究者利用subCluster分析，將B細胞定義為5個細胞亞群（圖2）：pDC細胞（表達CLEC4C），pro-B細胞（表達HLA-DRA和CD74），成熟B細胞（表達CD23和CD24）和漿細胞（包括P1和P2，表達J-chain）。經(jīng)過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)（表1），相較于新骨折組織（Control組），骨折30天的組織（Case組）B細胞數(shù)量顯著減少，擬時序分析發(fā)現(xiàn)Case組各時期B細胞構(gòu)成與對照組相似，在血腫形成階段，所有B細胞亞群均減少，提示了B細胞可能影響了骨折愈合過程。

圖2 人骨折組織B細胞分群分析

表1 新、舊骨折組織不同免疫細胞類型數(shù)量占比

3、小鼠骨折模型中B細胞的研究

進一步，研究者建立了小鼠骨折模型（圖3），分別在0、3、7、14d采集小鼠骨折組織細胞，獲得6個B細胞亞群：T2B、T1B、B1、B2、B1b1和B1b2。通過擬時序、細胞通訊、GO富集分析和免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，在骨痂形成過程中，B細胞的減少促進了成骨細胞和破骨細胞的分化，而在骨痂愈合過程中，B細胞的增加抑制了成骨細胞和破骨細胞的分化（圖4），即B細胞在骨折愈合過程中發(fā)揮了重要作用。

圖3 小鼠骨折模型

圖4 小鼠骨折模型中B細胞的作用

4、B細胞外泌體體外和體內(nèi)作用

研究者進一步通過體外細胞培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)，與B細胞共培養(yǎng)后，破骨細胞分化增加，成骨細胞分化減少。后經(jīng)過免疫印跡、RT-qPCR等實驗（圖5），證實了B細胞外泌體在體外抑制成骨細胞分化，促進破骨細胞形成。

圖5 B細胞外泌體體外實驗

最后研究者將B細胞外泌體注射到小鼠體內(nèi)連續(xù)8周，發(fā)現(xiàn)實驗組小鼠的骨小梁體積、數(shù)量和厚度顯著低于對照組，骨小梁間距顯著高于對照組（圖6）。

圖6 B細胞外泌體體內(nèi)實驗

結(jié)論

綜上所述，文章通過單細胞轉(zhuǎn)錄組測序等技術(shù)，解析了在骨折愈合不同階段，骨髓微環(huán)境中免疫細胞類型的變化，發(fā)現(xiàn)B細胞在骨折愈合過程中的重要作用。另外，B細胞外泌體可以調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞的分化，為B細胞外泌體研發(fā)治療骨折或骨質(zhì)疏松等疾病的納米藥物提供新的思路。

原文鏈接

https://doi.org/10.3389/fendo.2021.666140