中南大學(xué)湘雅醫(yī)院范學(xué)工教授課題組通過高通量測序手段，對表達(dá)HBx基因的肝細(xì)胞中miRNA-mRNA之間的相互調(diào)控進(jìn)行研究，研究成果發(fā)表于World Journal of Gastroenterology，烈冰在該工作中提供了高通量測序和生物信息分析服務(wù)及技術(shù)支持。

肝細(xì)胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，俗稱“癌中之王”。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年有超過74.5萬的患者因HCC死亡，對其發(fā)病機(jī)制、診斷方法和治療手段的研究更是如火如荼[1,2]。流行病學(xué)調(diào)查表明，長期慢性乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus, HBV）感染是導(dǎo)致HCC的主要病因，這種情況在亞洲更為常見[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒X基因（Hepatitis B Virus X, HBx）在HBV相關(guān)HCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，肝細(xì)胞中HBx基因的表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)胞增殖、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白降解及凋亡[4-9]，但具體的分子機(jī)制尚有待闡明。miRNA作為一類內(nèi)源性小分子RNA，參與基因表達(dá)、細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程。已有研究表明有多個(gè)miRNA家族，例如miR-122、miR-125、miR-199等，與HBV相關(guān)HCC的發(fā)生密切相關(guān)[10]。

本篇文章以“Integrated analysis of microRNA and mRNA expression profiles in HBx-expressing hepatic cells”為題發(fā)表于 World Journal of Gastroenterology雜志，研究團(tuán)隊(duì)來自中南大學(xué)湘雅醫(yī)院范學(xué)工教授課題組，NovelBio在該工作中提供了高通量測序和生物信息分析服務(wù)及技術(shù)支持。該研究對轉(zhuǎn)染HBx基因的肝細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）和miRNA測序（miRNA-Seq），并通過對測序數(shù)據(jù)的分析繪制了miRNA-mRNA核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為HBV相關(guān)HCC的分子機(jī)制研究提供了新的思路和研究靶點(diǎn)。

Methods

研究者建立了可穩(wěn)定表達(dá)HBx基因的人類肝臟細(xì)胞系L02，命名為L02/HBx，作為實(shí)驗(yàn)組；以轉(zhuǎn)染了空白質(zhì)粒的L02/pcDNA作為對照組，分別進(jìn)行mRNA-Seq和miRNA-Seq，篩選出L02/HBx組中發(fā)生差異表達(dá)的mRNA和miRNA。之后借助GO分析和KEGG Pathway富集分析來評估候選分子標(biāo)志物（Biomarker）的功能，并通過調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建分析差異miRNA和mRNA的相互作用關(guān)系。

分析思路

Results

差異基因表達(dá)譜分析

首先，研究者通過比較兩組細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，在L02/HBx細(xì)胞中篩選出1243個(gè)差異表達(dá)的基因，其中742個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，另外501個(gè)基因表達(dá)下調(diào)（Figure1A）。研究者接著分別對這兩組基因中上調(diào)和下調(diào)差異較顯著的20個(gè)基因做了聚類分析（Figure1B）。

Figure1A. L02/HBx和L02/pcDNA細(xì)胞的RNA-Seq整體差異基因表達(dá)譜

Figure1B. 差異較顯著的20個(gè)上調(diào)基因和20個(gè)下調(diào)基因

從這些差異基因中，研究者進(jìn)一步鎖定了5個(gè)上調(diào)基因---GPR6、KLHL31、FOXC1、UGT1A7 和MAGEA4，以及4個(gè)下調(diào)基因---SLC22A14、PCOLCE、A2M和KIAA1522，這些差異基因分別參與了DNA復(fù)制、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞粘附、代謝進(jìn)程、腫瘤轉(zhuǎn)化等信號通路。研究者通過qPCR對這9個(gè)候選基因的表達(dá)進(jìn)行定量驗(yàn)證，定量結(jié)果與測序結(jié)果完全一致（Figure1C, D）。

Figure1C. 候選差異基因的qPCR驗(yàn)證

Figure1D. 測序結(jié)果與qPCR定量結(jié)果的相關(guān)性分析

GO/KEGG Pathway富集分析

為了闡明差異表達(dá)的基因與HBx相關(guān)HCC的發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，NovelBio團(tuán)隊(duì)協(xié)助研究者對1243個(gè)差異基因進(jìn)行了GO功能富集分析和KEGG Pathway富集分析（Figure2A，B）。

Figure2A.差異基因的GO功能富集分析

Figure2B.差異基因的KEGG Pathway富集分析

miRNA表達(dá)分析

完成對差異基因的分析之后，文章接著對miRNA的表達(dá)進(jìn)行差異篩選。結(jié)果顯示，與L02/pcDNA細(xì)胞相比，L02/HBx細(xì)胞中6個(gè)miRNA表達(dá)發(fā)生下調(diào)，16個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)（Figure3）。研究者對其中4個(gè)差異miRNA進(jìn)行 qPCR表達(dá)量驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果與測序結(jié)果一致。

Figure3. L02/HBx細(xì)胞與L02/pcDNA細(xì)胞之間發(fā)生差異表達(dá)的miRNA

miRNA和mRNA表達(dá)譜整合分析

考慮到通過網(wǎng)絡(luò)圖鎖定核心miRNA群具有較高的預(yù)測準(zhǔn)確度，研究者采用以下策略對L02/HBx細(xì)胞進(jìn)行miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建（Figure4A）。

Figure4A. miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建策略

通過專業(yè)miRNA分析軟件miRnada和TargetScan，NovelBio團(tuán)隊(duì)協(xié)助研究者成功預(yù)測出miRNA的潛在靶基因，然后結(jié)合靶基因群的表達(dá)模式（Figure1A），鎖定一系列顯著相關(guān)的miRNA-mRNA靶向關(guān)系。從這些關(guān)系中，研究者根據(jù)Degree值挑選出11個(gè)處于核心地位的miRNA，并繪制了miRNA-mRNA靶向調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（Figure4B）。該網(wǎng)絡(luò)圖中，與miR340-5p形成靶向關(guān)系的基因數(shù)目最多，另外有幾個(gè)miRNA可通過組合的方式共同調(diào)控某些靶基因。

Figure4B. miRNA靶向調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

為進(jìn)一步縮小范圍，鎖定核心miRNA，研究者對這些靶基因進(jìn)行了功能富集分析，挑選出其中與腫瘤信號通路（譬如DNA復(fù)制、基因表達(dá)、細(xì)胞周期、細(xì)胞分裂等）密切相關(guān)的基因，繪制核心miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（Figure4C）。由該圖可以推測，L02/HBx細(xì)胞中發(fā)生上調(diào)的miRNA，如hsa-miR-7-5p和hsa-miR-182-5p，可能抑制了其靶基因MEF2C和GLI3的表達(dá)，從而促進(jìn)了細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；而L02/HBx細(xì)胞中發(fā)生下調(diào)的miRNA，包括hsa-miR-501-5p、hsa-miR-340-5p、hsa-miR-324-5p和hsa-miR-488-3p等，則由于表達(dá)量的降低減弱了對靶基因（如JAK1、MAPK1、STX3、BCL10等）的抑制效應(yīng)，這些基因的激活可能會在HBx相關(guān)HCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定的促進(jìn)作用。

Figure4C. 核心miRNA靶向調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

肝癌的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜生物學(xué)過程，涉及一系列的基因和細(xì)胞因子，而miRNA參與的基因調(diào)控可能在其中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。在該篇研究之前已有研究報(bào)道多個(gè)miRNA，譬如hsa-miR-338-3p和hsa-miR-29c等，與HBx相關(guān)HCC的發(fā)展密切相關(guān)[11]。但鮮少有研究者將視線聚焦到miRNA和mRNA之間的靶向調(diào)控和相互作用。該研究借助二代測序手段，結(jié)合深入的生物信息學(xué)分析，首次對相關(guān)miRNA和mRNA進(jìn)行了整合分析，繪制了miRNA-mRNA核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此項(xiàng)研究成果不僅有望揭示HCC細(xì)胞中HBx蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制，還為其臨床診斷和治療提供了有價(jià)值的診斷標(biāo)志物和藥物靶點(diǎn)。

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參考文獻(xiàn)

1. Jemal A, et al. CA Cancer J Clin 2011; 61: 69-90

2. Ma L, et al. Oncotarget 2015; 6: 25390-25401

3. Okuda K. J Hepatol 2000; 32: 225-237

4. Yang ST, et al. J Hepatol 2013; 58: 1157-1164

5. Shi L, et al. Virus Res 2016; 223: 131-139

6. Murakami S. J Gastroenterol 2001; 36: 651-660

7. Matsuda Y, et al. Med Mol Morphol 2009; 42: 138-142

8. Cheng P, et al. Oncol Rep 2009; 22: 1101-1107

9. Ma NF, et al. Clin Cancer Res 2008; 14: 5061-5068

10. Meng F, et al. Gastroenterology 2007; 133: 647-658

11. Lamontagne J, et al. World J Gastroenterol 2015; 21: 7375-7399