骨髓是構(gòu)成終生血液生成和骨骼再生的主要部位。在骨髓微環(huán)境（BM niches）中，不同的間充質(zhì)細(xì)胞、脈管系統(tǒng)和分化的造血細(xì)胞相互作用，以調(diào)節(jié)造血和間充質(zhì)干細(xì)胞（分別為HSC和MSC）的維持和分化。但是，其細(xì)胞和空間組織仍存在爭(zhēng)議。近日，來自歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室（EMBL）等機(jī)構(gòu)的科學(xué)家們結(jié)合單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)系統(tǒng)地繪制了小鼠不同骨髓造血微環(huán)境的分子，細(xì)胞和空間組成；分析了所有主要的骨髓駐留細(xì)胞類型，對(duì)其進(jìn)行空間定位并闡明了促造血因子的來源；最后開發(fā)了一種RNA-Magnet算法，可以從單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中準(zhǔn)確地推斷出細(xì)胞的三維組織架構(gòu)。

分析思路：

測(cè)序樣本信息：

8到12周C56Bl/6J雌性小鼠的股骨，脛骨，髖和脊椎骨

測(cè)序平臺(tái)：

10x Genomics系統(tǒng)，Illumina NextSeq 500

細(xì)胞分選平臺(tái)：

使用FACS進(jìn)行分選：CD45-CD71+細(xì)胞（紅系祖細(xì)胞）

CD45-CD71-（非造血細(xì)胞）

研究結(jié)果：

1.通過scRNA-Seq鑒定和描述BM駐留細(xì)胞類型

研究者首先對(duì)小鼠的骨髓組織進(jìn)行scRNA-Seq。為了同時(shí)捕獲高豐度和稀有的BM駐留細(xì)胞，在對(duì)小鼠總BM進(jìn)行scRNA-Seq后，通過逐漸消耗豐富的細(xì)胞類型或從未消化的BM或酶消化的骨組織中對(duì)稀有細(xì)胞類型進(jìn)行富集然后進(jìn)行scRNA-Seq。

對(duì)得到的7,497個(gè)細(xì)胞進(jìn)行t-SNE分析，共分出32個(gè)亞群，分別對(duì)應(yīng)于不同的細(xì)胞類型或分化階段。利用marker基因的表達(dá)，GO分析等方法對(duì)細(xì)胞類型進(jìn)行判斷，鑒定出主要的造血細(xì)胞類型，包括樹突狀細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞，不同發(fā)育階段的T細(xì)胞和B細(xì)胞，以及CD45低表達(dá)并表達(dá)紅系細(xì)胞marker（如CD71）的紅系祖細(xì)胞。

圖1 通過scRNAseq鑒定BM駐留細(xì)胞類型

剩下的2%細(xì)胞為非造血細(xì)胞，不表達(dá)CD45和CD71。包括施旺細(xì)胞（Mog，Mag），平滑肌細(xì)胞（Tagln，Acta2），肌成纖維細(xì)胞，9種不同的Pdgfra陽性間充質(zhì)細(xì)胞和兩個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞（EC）群體（Cdh5，Pecam）。其中內(nèi)皮細(xì)胞包括表達(dá)Sca1（Ly6a）的動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和表達(dá)Emcn的竇狀內(nèi)皮細(xì)胞；間充質(zhì)細(xì)胞包含軟骨細(xì)胞（Acan，Sox9），成骨細(xì)胞（Osteocalcin / Bglap，Col1a1）和幾種其它細(xì)胞類型，包括三個(gè)不同的成纖維細(xì)胞cluster，以及另外兩個(gè)與前人報(bào)道的SCF-綠色熒光蛋白（GFP）陽性和Cxcl12 –GFP 陽性的Cxcl12-abundant reticular（CAR）細(xì)胞表現(xiàn)出高度轉(zhuǎn)錄組相似性的細(xì)胞群體。值得注意的是，這兩個(gè)亞群差異表達(dá)脂肪細(xì)胞和骨細(xì)胞系的基因，因此分別將其命名為Adipo-CAR和Osteo-CAR細(xì)胞。其中Adipo-CAR細(xì)胞表達(dá)高水平的瘦素受體（Lepr），并與LepR–Cre細(xì)胞表現(xiàn)出高度的轉(zhuǎn)錄組相似性。相反，Osteo-CAR細(xì)胞表達(dá)較高水平的成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子osterix（Sp7）和較低水平的Lepr。另外，研究者還鑒定到一群表達(dá)Ng2和Nestin的間充質(zhì)細(xì)胞，它們與前人描述的Ng2 + Nestin + MSC在轉(zhuǎn)錄組上具有相似性，將其命名為Ng2 + MSC。

最后，研究者利用偽時(shí)序分析構(gòu)建了所有間充質(zhì)細(xì)胞類型的分化軌跡，Ng2 + MSCs為分化起始細(xì)胞，下游分別為成骨細(xì)胞，CAR細(xì)胞，軟骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。該研究中沒有發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞，神經(jīng)元和成熟的巨核細(xì)胞，這可能是由于對(duì)捕獲的細(xì)胞大小的限制。

圖2 BM駐留細(xì)胞類型的鑒定

2.通過結(jié)合單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組對(duì)BM駐留細(xì)胞進(jìn)行空間定位

研究者開發(fā)了一種改進(jìn)的激光捕獲顯微解剖結(jié)合測(cè)序（LCM-Seq），根據(jù)竇和小動(dòng)脈血管是否存在或根據(jù)距骨內(nèi)膜的距離，從BM組織收集76個(gè)微解剖區(qū)域，利用LCM-Seq，對(duì)骨內(nèi)膜，骨膜下，竇和小動(dòng)脈，非血管的微環(huán)境組成進(jìn)行了描述。

圖3通過結(jié)合單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組分析對(duì)BM駐留細(xì)胞進(jìn)行空間分配

為了評(píng)估新開發(fā)的空間轉(zhuǎn)錄組的方法，研究中比較了各微環(huán)境的marker基因在scRNA-Seq和相應(yīng)的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)中的表達(dá)情況。成骨細(xì)胞基因在內(nèi)皮細(xì)胞中選擇性富集，竇內(nèi)皮特異的基因在血竇豐富的區(qū)域富集，而動(dòng)脈內(nèi)皮基因在小動(dòng)脈富集。造血，施旺細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的marker基因集合與任何微環(huán)境均無顯著相關(guān)性，表明這些細(xì)胞類型在微環(huán)境中的分布相對(duì)均勻，或者表明在LCM-Seq中數(shù)據(jù)覆蓋不足。相反，其余12個(gè)細(xì)胞群體的marker基因表達(dá)在各個(gè)微環(huán)境之間存在顯著差異。為了系統(tǒng)地評(píng)估這些BM細(xì)胞類型對(duì)候選微環(huán)境的優(yōu)先定位，研究者使用CIBERSORT算法估算了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)中可以由scRNA-Seq定義的細(xì)胞類群的頻率。結(jié)果表明，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)的整合，能夠?qū)⒋蠖鄶?shù)鑒定的以及未知的BM細(xì)胞群體定位于不同的骨內(nèi)膜，竇和小動(dòng)脈以及非血管等微環(huán)境。

3. 細(xì)胞類型定位的驗(yàn)證

為了確認(rèn)通過LCM-Seq鑒定的BM細(xì)胞類型的空間關(guān)系，研究者利用針對(duì)特定細(xì)胞群體的marker基因組合，對(duì)骨切片進(jìn)行了免疫熒光染色。

圖4使用免疫熒光法對(duì)CAR細(xì)胞亞型進(jìn)行定位

基因表達(dá)分析表明，堿性磷酸酶（Alpl）和Cxcl12的表達(dá)可以區(qū)分Osteo-CAR（Cxcl12 + Alpl +），Adipo-CAR細(xì)胞（Cxcl12 + Alpl-）和Cxcl12-Alpl +細(xì)胞類型，例如成骨細(xì)胞，Ng2 + MSC和動(dòng)脈EC。與小動(dòng)脈marker基因Emcn的共同染色顯示，中央BM中的Cxcl12 + Alpl- Adipo-CAR細(xì)胞主要包被在小動(dòng)脈中，與LCM-seq結(jié)果一致。相反，中央BM中的Cxcl12 + Alpl + Osteo-CAR細(xì)胞通常表現(xiàn)出非動(dòng)脈定位和高度網(wǎng)狀形態(tài)。重要的是，在Sca1 + GFP^dim小動(dòng)脈的附近也經(jīng)常觀察到Cxcl12 + Alpl + Sca1^low的Osteo-CAR細(xì)胞，其中GFP^high的Osteo-CAR突起密集地覆蓋了小動(dòng)脈血管。這些結(jié)果證明了Osteo-CAR細(xì)胞的非竇性定位，并且定性地證實(shí)了這些細(xì)胞定位于小動(dòng)脈和非血管區(qū)域，與LCM-Seq預(yù)測(cè)的結(jié)果一致。

圖5 使用免疫熒光法對(duì)其他間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行定位

接下來，研究者使用CD31，SM22，Pdpn，Pdgfr，Col1a1和Sca1作為marker，來特異性鑒定和定位平滑肌細(xì)胞（SM22 + Pdpn-），成纖維細(xì)胞（Pdpn + Pdfgr +），成骨細(xì)胞（Pdpn-Col1a1 +）和動(dòng)脈EC。結(jié)果證明了LCM-Seq的方法識(shí)別未知的細(xì)胞類型如Adipo和Osteo-CAR細(xì)胞，并將其在BM中進(jìn)行空間定位的能力。

4. 利用scRNA-Seq數(shù)據(jù)準(zhǔn)確預(yù)測(cè)BM駐留細(xì)胞類型的空間關(guān)系

研究者編制了一份完整注釋的細(xì)胞粘附受體及其同源質(zhì)膜或細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合配體的列表，并開發(fā)了RNA-Magnet算法，通過細(xì)胞粘附分子的差異表達(dá)來預(yù)測(cè)BM的細(xì)胞類型特異性定位。為了研究RNA-Magnet算法是否能夠判斷BM細(xì)胞類型間的空間定位關(guān)系，研究者引入了四個(gè)微環(huán)境群體：骨內(nèi)膜微環(huán)境的成骨細(xì)胞，竇內(nèi)皮細(xì)胞，小動(dòng)脈微環(huán)境的動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。模擬計(jì)算表明，BM細(xì)胞群體對(duì)不同微環(huán)境的粘附性，與它們的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的差異定位程度密切相關(guān)，證明了RNA-Magnet算法利用單細(xì)胞基因表達(dá)數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)細(xì)胞空間定位的能力。

圖6 利用RNA-Magnet從單細(xì)胞基因表達(dá)數(shù)據(jù)推斷細(xì)胞相互作用

5. 骨髓中細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的細(xì)胞和空間來源

發(fā)生在BM中的關(guān)鍵生物學(xué)過程被認(rèn)為是由多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的協(xié)同作用共同介導(dǎo)的。然而，對(duì)于產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞及其在BM微環(huán)境中的空間組織和功能仍然知之甚少。為了在蛋白質(zhì)水平上確認(rèn)Adipo-和Osteo-CAR細(xì)胞的Cxcl12表達(dá)，研究者開發(fā)了FACS的策略來區(qū)分這些細(xì)胞類型，并使用基于FACS的index-scRNAseq進(jìn)行了確認(rèn)。對(duì)比分析表明，Adipo-CAR細(xì)胞為CD45-CD71-Ter119-CD41-CD51 + VCAM1 + CD200^mid CD61^low，而Osteo-CAR和NG2 + MSC高表達(dá)CD200和CD61。在所有BM細(xì)胞類型中，CAR細(xì)胞產(chǎn)生的不同細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子最多，這表明CAR細(xì)胞是“專業(yè)的細(xì)胞因子產(chǎn)生細(xì)胞”。研究者根據(jù)這些觀察結(jié)果提出了一個(gè)模型，在該模型中，專業(yè)產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞的差異定位導(dǎo)致建立了特定的微環(huán)境。

圖7 BM中關(guān)鍵細(xì)胞因子的細(xì)胞和空間來源

6. BM細(xì)胞類型的細(xì)胞間信號(hào)相互作用分析

最后，研究者將RNA-Magnet算法應(yīng)用于可溶性信號(hào)傳導(dǎo)介質(zhì)（例如細(xì)胞因子，生長(zhǎng)因子等）及其受體，獲得了潛在的細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)相互作用的系統(tǒng)概述。利用RNA-Magnet分析得到的網(wǎng)絡(luò)形成了兩個(gè)斷開的信號(hào)簇，分別由成熟的免疫或非造血細(xì)胞組成，表明免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞優(yōu)先在各自的分組內(nèi)進(jìn)行通訊，說明不同的BM生物過程是由來自不同局部微環(huán)境的特定組合信號(hào)介導(dǎo)的。

圖8 BM中信號(hào)傳導(dǎo)潛力的系統(tǒng)級(jí)分析

總之，研究者開發(fā)的新方法就能夠幫助揭示BM細(xì)胞的組成，即三維組織架構(gòu)，以及細(xì)胞之間是如何進(jìn)行相互作用的。研究人員利用該方法可以研究諸如白血病等血液疾病發(fā)生的分子機(jī)制，開發(fā)新型療法。除此之外，新方法還能在多種組織中應(yīng)用，用來確定組織中細(xì)胞的空間架構(gòu)，研究人類疾病的復(fù)雜病理學(xué)機(jī)制。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41556-019-0439-6

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)ｎ}

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